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实验2蛋白质等电点和含量的测定_科学_高等教育_教育领域

浏览 194次 来源:【jake推荐】 作者:-=Jake=-    时间:2021-02-11 02:23:56
[摘要] 蛋白质等电点及含量测定P40/P51【温馨提示】?201蛋白质等电点的测定【实验原理】——pH值沉淀法测定蛋白质等电点?本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定,即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值。——pH值沉淀法测定蛋白质等电点?——pH值沉淀法测定蛋白质等电点?

实验2蛋白等电点和含量测定P40 / P51 [提醒]? 1个可见光分光光度计,带4个玻璃比色杯,使用后请立即洗涤并干燥。切勿使用试管刷或粗糙的布(纸)擦拭。 ?实验结束后yb体育 ,请务必洗涤,干燥并将用过的玻璃器皿放回原处。 1 [实验目的]?了解蛋白质的两性解离特性,掌握通过pH方法确定蛋白质等电点的一般原理和操作方法。 ?学习并掌握缩二脲法测定蛋白质浓度的原理和操作方法。 201测定蛋白质等电点[实验原理] -pH值沉淀法测定蛋白质等电点?蛋白质是两性电解质yb体育 ,溶液中存在以下平衡:4 [实验原理] -pH值沉淀法确定蛋白质的等电点蛋白质分子的净电荷为零的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。在等电点,蛋白质分子不会移动到电场中的任何极点,并且由于分子之间的碰撞而导致分子凝结的趋势增加,因此可以将蛋白质溶液的粘度和渗透压降低到最低这次。溶液变得浑浊。 ?牛奶中酪蛋白的等电点为4. 7- 4. 8。该实验使用蛋白质在不同pH溶液中形成的浊度来确定,即最大浊度下的pH值为蛋白质的等电点。 5 [仪器和试剂耗材]-用pH值沉淀法测定蛋白质等电点?实验仪器? 4个15mL玻璃试管,移液器,耳灯泡,移液器(200uL),移液器吸头(200uL)等。

?实验材料和试剂?蒸馏水亚博lol ,1M乙酸,0. 1M乙酸,0. 01M乙酸,酪蛋白溶液。 6 [操作步骤] -pH值沉淀法测定蛋白质的等电点?每组取4个15mL玻璃试管,并按下表所示顺序准确添加试剂,添加后立即混合,添加一支,摇动一支。 1M H2O 0. 01M HAC 0. 1MHAC HAC管数/ mL / mL / mL / mL 1 8. 40 0. 6 2 8. 7 0. 3 3 8. 00 1. 00 4 7. 40 1. 60pH 5. 9 5. 3 4. 7 3. 5酪蛋白溶解观察现象(min)溶液0 10 20 / mL 1 1 1 1?站立并观察不同时间的浊度。最浑浊的试管的pH值是酪蛋白的等电点。观察时,可以使用+,++,+++指示浊度。 7 [实验结果与分析] ——pH值沉淀法测定蛋白质的等电点?观察每个试管的清晰度变化,记录结果(使用+yabo2020 ,++,+++表示浊度)并解释该现象。 ?确定酪蛋白的等电点。 8 [问题]等电点处蛋白质沉淀的原因是什么?有哪些因素会影响实验结果的准确性? 02蛋白质含量的测定缩二脲法测定蛋白质含量[实验原理]-缩二脲法测定蛋白质含量?缩二脲(NH3CONHCONH 3)是一种两分子尿素,在约180°C的温度下加热可释放1分子氨。得到的产物。

?在强碱性溶液中,缩二脲可以与Cu形成紫红色复合2+化合物,这称为缩二脲反应。 ?具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键或可通过中间碳原子连接的肽键的任何化合物均具有缩二脲反应。蛋白质包含多个肽键,可以发生缩二脲反应。 11 [实验原理]-缩二脲法测定蛋白质含量?紫色-红色复合色的强度与蛋白质浓度成正比,与蛋白质分子量和氨基酸组成无关。可以在540 nm处比色法测量色强度酪蛋白等电点测定结果,因此可以使用该方法确定蛋白质含量。测得的蛋白质浓度范围是1-10 mg / mL。 ?这种方法的优点是速度更快,不同的蛋白质产生相似的颜色,并且几乎没有干扰物质。主要缺点是灵敏度差。因此,缩二脲方法通常用于快速但不是非常精确的蛋白质测定。 12 [仪器和试剂消耗品] -Biuret方法测定蛋白质含量?实验仪器? 6个15mL玻璃试管,移液器,耳灯泡,移液器(200uL),移液器吸头(200uL),可见光分光光度计等待。 (绘制标准曲线)2个15mL玻璃试管,移液器,耳灯泡,移液器(200uL),移液器吸头(200uL),可见光分光光度计等。(样品测定)?实验材料和试剂? Biuret试剂,标准牛血清白蛋白,蒸馏水和待测样品(可以使用酪蛋白溶液或从牛奶中提取的酪蛋白)。

13【操作步骤】-用缩二脲法测定蛋白质含量? 1.标准曲线图。 (全班抽1份)?取6个15mL试管,编号为0-5,并按下表所示顺序添加试剂。试剂/ mL标准牛血清白蛋白蒸馏水缩二脲试剂蛋白含量mg / mL试管0 0. 0 2. 0 4. 0 0. 0 1 0. 4 1. 6 4. 0 2. 0 2 0. 8 1. 2 4. 0 4. 0 3 1. 2 0. 8 4. 0 6. 0 4 1. 6 0. 4 4. 0 8. 0 5 2. 0 0. 0 4. 0 1 0. 014 [操作步骤] -Biuret方法确定蛋白质含量?加入上述试剂后,充分混合,并在室温下放置30分钟。 ?将管0作为对照管,比色法在540 nm处测量吸光度,并记录每个管的吸光度。 ?以每个试管的蛋白质含量为横坐标,以相应的吸光度为纵坐标,绘制吸光度-蛋白质含量标准曲线。 (参见计算机桌面Excel表中的“标准曲线图”)15【操作步骤】-用缩二脲法测定蛋白质含量? 2.蛋白质样品的测定(每组1个)1.分别取2个试管,分别加入1 mL未知浓度的酪蛋白蛋白质样品溶液(注意样品浓度不应超过10 mg / mL)酪蛋白等电点测定结果, 1 mL蒸馏水,加入4 mL缩二脲试剂,充分混合,然后在室温下放置30分钟。 2.用比色法在540nm处测量了2种样品溶液的吸光度。

3.取两组样品测得的吸光度的平均值,并根据回归方程计算相应的蛋白质浓度。 y = 0. 042x- 0. 0004 4.根据以下公式计算样品蛋白质含量:样品蛋白质含量(mg / 100 mL)= Y×N×100 / V,其中Y为标准曲线的量蛋白质(mg),N是稀释因子,V是样品体积(mL)。 16 [实验结果与分析]-缩二脲法测定蛋白质含量1.绘制蛋白质标准曲线2.计算样品蛋白质含量样品蛋白质含量(mg / 100 mL)= Y×N×100 / V其中,Y是通过标准曲线找到的蛋白质量(mg),N是稀释因子,V是样品体积(mL)。 17 [问题]影响标准曲线的因素有哪些? ?测定蛋白质含量时应注意哪些问题? 18 [注意事项]等电点测定实验要求各种试剂的浓度和添加量必须非常准确。 ?标准曲线的选择不仅要看R,还要看曲线的斜率和截止距离。 R的大小与实验操作和仪器有关。 2?如果显色时间过长,可能会出现雾状沉淀,这会影响颜色比较。 (解决方案:尽快进行颜色比较)?脂肪物质会影响反应。 (使用乙醇或石油醚澄清溶液并离心,然后将澄清溶液进行测试)?测量样品管的吸光度时,吸光度值应在标准曲线范围内。如果超过,则在测量前应适当稀释样品。 19

老王
本文标签:等电点,双缩脲法,标准曲线

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